Autores: Eva del Río Pons
Jorge Estévez Doménech
Eugenio Vilanova Gisbert
Miguel Ángel Sogorb Sánchez (responsable)
Actividad práctica del Área de Toxicología
Universidad Miguel Hernández de Elche
1 RESUMEN
El propósito del ensayo es determinar el efecto del carbaryl sobre el crecimiento de algas verdes unicelulares del género Chlorella vulgaris. El efecto de la sustancia se determina tras 24, 48 y 72 horas de exposición continuada del cultivo a la sustancia evaluada. Determinaremos las concentraciones sin efecto, y las que son capaces de inhibir un 50% el crecimiento y la velocidad de crecimiento del alga.
2 OBJETIVOS
El alumno deberá ser capaz de:
- realizar en el laboratorio las operaciones necesarias para ensayar la ecotoxicidad de muestras problema aplicando el ensayo de inhibición del crecimiento de algas.
- estimar las EC50 de crecimiento y velocidad de crecimiento de una muestra problema a partir de los datos experimentales obtenidos en un ensayo de ecotoxicidad de inhibición del crecimiento de algas.
- realizar un informe normalizado de un ensayo de ecotoxicidad a partir de los datos obtenidos en un ensayo con algas verdes.
3 PRECAUCIONES
Deben respetase las normas generales de seguridad aplicables en cualquier laboratorio así como las normas específicas indicadas en el laboratorio en donde se realiza la actividad. En casos de duda debe siempre consultar al profesor o responsable del laboratorio. Debe informar de cualquier anomalía que observe, rotura de material o situaciones de peligro para los demás usuarios.
- Consejos de seguridad para los estudiantes
- Seguridad y salud en los laboratorios y talleres de la UMH
4 EL ENSAYO DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE ALGAS VERDES (PROTOCOLO C3)
5 PREPARACIÓN DE BOLD’S BASAL MEDIUM (BBM) PARA EL CULTIVO DE LAS ALGAS
El agua empleada para preparar el medio de cultivo debe ser desionizada y con una conductividad inferior a 5 μS cm-1. El destilador empleado para preparar dicha agua no debe contener ninguna parte de cobre. El pH del medio resultante después de la oxigenación debe ser aproximadamente 8.
6 CONDICIONES DE CULTIVO
La temperatura de la cámara o cabina de cultivo debe fijarse en el rango de 21-25 °C con una variación máxima de ±2 °C. La cámara de cultivo debe poseer una iluminación con un espectro continuo de luz de 400 a 700 nm. La intensidad de la iluminación debe situarse en el rango de 60 a 120 μE m-1 s-1 (35 a 70 fotones m-1 s-1). Dichas condiciones lumínicas pueden conseguirse empleando entre 4 y 7 lámparas fluorescentes de luz blanca de 30 W situadas a unos 35 cm del cultivo.
7 MEDIDAS DE LA DENSIDAD CELULAR
Los métodos empleados para determinar la densidad celular de los cultivos suelen ser el recuento directo con microscopio utilizando una cámara de contaje, aunque también están permitidas otras técnicas como la turbidimetría y colorimetría así como el uso de metodologías más complejas como la citometría de flujo.
En esta práctica utilizaremos el método más sencillo basado en el recuento del número de células contenidos en un volumen determinado de medio de cultivo.
8 REALIZACIÓN DEL ENSAYO
Idealmente, se deben ensayar al menos cinco diferentes concentraciones calculadas siguiendo una progresión geométrica con una razón no superior a 2.2. La concentración más baja ensayada no debería causar efecto significativo sobre el crecimiento celular, mientras que la más alta debería inhibir el crecimiento al menos el 50% (preferiblemente el 100%). Cada concentración y todos los controles deben ser ensayados al menos con tres replicados.
El pH del medio debe ser determinado al inicio y a las 72 h y en los cultivos control no debería desviarse más de 1.5 unidades.
Ensayo límite Se puede realizar un ensayo límite a la concentración de 100 mg/l o al límite de solubilidad de la sustancia ensayada para determinar si la EC50 es superior a esta concentración. En el ensayo límite los controles y las muestras deben también ser ensayado por triplicado. Si en el ensayo límite se detecta una disminución del crecimiento o de la velocidad de crecimiento del 25% se deberá proceder a realizar un ensayo completo.
9 RESULTADOS DEL ENSAYO
|
Densidad celular (x 10.000) |
||||
|
[carbaryl] (µg/l) |
0 horas |
24 horas |
48 horas |
72 horas |
|
0 |
1 |
9 |
57 |
150 |
|
0,91 |
1 |
10 |
56 |
144 |
|
1,46 |
1 |
9 |
50 |
126 |
|
2,34 |
1 |
7 |
45 |
100 |
|
3,75 |
1 |
4 |
30 |
60 |
|
5,89 |
1 |
1 |
6 |
20 |
10 EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS
11 BIBLIOGRAFÍA
12 MATERIAL COMPLEMENTARIO